Сочетанная конфокальная лазерная эндомикроскопия и эндоцитоскопия в исследовании микроструктуры слизистой оболочки желудка при предраковых заболеваниях и раннем раке желудка
Пирогов С.С., Соколов В.В., Карпова Е.С., Павлов П.В., Погорелов Н.Н., Сухин Д.Г.
ФГБУ «МНИОИ им. П.А. Герцена» Минздрава РФ, г. Москва
В последние 10 лет в мире активно ведется разработка подходов к исследованию слизистой оболочки желудка в аспекте поиска ранних неопластических изменений и предраковых состояний с высоким риском малигнизации. В 2005 – 2008 годах с появлением технологии узкоспектральной эндоскопии (NBI) появилась возможность исследования архитектоники ямок слизистой оболочки и по ее нарушению – нерегулярности или отсутствию, судить о предположительном наличии диспластических изменений эпителия слизистой оболочки желудка или ранней неоплазии. В 2009 – 2011 годах технология NBI была дополнена оптическим увеличением изображения в 80 – 150 раз, что позволило оценивать не только архитектонику ямок слизистой оболочки, но и состояние внутрисосочковых капиллярных петель. Их расширение, избыточная извитость, деформация с большей точностью свидетельствовали о наличии различных этапов локальной неопластической прогрессии слизистой оболочки желудка.
С появлением в 2012 – 2013 годах технологий эндоскопии сверхвысокого увеличения – конфокальной лазерной эндомикроскопии (КЛЭ) и эндоцитоскопии (ЭЦ) точность исследования слизистой оболочки желудка вышла на новый уровень. С использованием данных методов появилась возможность оценки слизистой оболочки желудка на микроструктурном уровне – тканевом и клеточном. КЛЭ и ЭЦ это принципиально разные эндоскопические методики, обеспечивающие сходные результаты. КЛЭ является флуоресцентным методом и визуализация микроструктуры слизистой оболочки желудка обеспечивается благодаря введению экзогенного флуорофора в слизистую оболочку желудка и регистрации ответной флуоресценции различных клеточных элементов и структур, накопивших флуорофор в различных концентрациях. Микроскопическое изображение при КЛЭ получается из оптического среза слизистой оболочки желудка толщиной до 5 микрон, формируемого конфокальной диафрагмой и оптической системой эндоскопа. Увеличение изображения, получаемого с помощью КЛЭ, составляет, по разным данным 450 – 1000 раз. ЭЦ – метод прямого оптического увеличения изображения слизистой оболочки, сходный с обычной световой микроскопией и обеспечивающий увеличение изображения в 570 раз.
В группу больных, которые были обследованы с применением КЛЭ и ЭЦ, включено 42 пациента с аденоматозными эпителиальными новообразованиями желудка с различной степенью дисплазии эпителия и 104 - с высокодифференцированной аденокарциномой желудка с инвазией опухоли в пределах слизистой оболочки и подслизистого слоя.
Для выполнения КЛЭ нами была использована эндомикроскопическая система Pentax ISC-1000 с конфокальным видеоэндомикроскопом Pentax EG-3870CIK диаметром 12,8 мм Для ЭЦ мы применяли видеоэндоцитоскоп Olympus XEC-300 с оптическим увеличением изображения в 570 раз. Диаметр вводимой части эндоцитоскопа Olympus XEC-300 составляет 3,4 мм, то есть данный видеоэндоскоп является так называемым baby-эндоскопом, вводимым в инструментальный канал материнского видеоэндоскопа. И, соответственно, проведение ЭЦ подразумевает использование одновременно двух видеоэндоскопических систем Olympus EVIS Exera II. Совместно с первой системой применяется двухканальный видеоэндоскоп высокого разрешения Olympus GIF-2TH180 диаметром 12,2 мм и инструментальными каналами 2,8 и 3,7 мм. В широкий (3,7мм) канал материнского двухканального видеоэндоскопа проводится эндоцитоскоп, включенный во вторую видеоэндоскопическую систему.
Алгоритм проведения КЛЭ включал предварительное медленное струйное введение больному внутривенно экзогенного флуорофора - 10 мл раствора флуоресцеина натрия с экспозицией в 1 минуту. По нашим данным, в 87,7% наблюдений данная продолжительность экспозиции обеспечивала адекватное распределение флуоресцеина натрия в слизистой оболочке желудка. Еще у 7 (4,8%) больных потребовалось большее время экспозиции – 3 минуты. У 11 (7,5%) пациентов не было достигнуто достаточной для проведения КЛЭ концентрации флуоресцеина натрия в слизистой оболочке желудка и в течение 10 минут после внутривенного его введения, что, возможно, может быть обусловлено индивидуальными особенностями васкуляризации слизистой оболочки желудка у конкретных пациентов. После проведения эндоскопа в желудок производилась тщательная санация слизистой оболочки от муцинозного налета с использованием 0,08% раствора Симетикона (разведение готовой суспензии 1:10), распыляемого через спрей-катетер, введенный в инструментальный канал эндомикроскопа. Получение эндомикроскопического изображения обеспечивалось плотным контактом дистального конца эндомикроскопа со слизистой оболочкой. Конфокальный видеоэндомикроскоп Pentax EG-3870CIK обладает возможностью изменения глубины сканирования от 20 до 250 микрон, однако, с учетом цели исследования – выявления диспластических изменений эпителия и фокусов аденокарциномы кишечного типа, которые локализуются в поверхностных слоях эпителия слизистой оболочки, во всех наблюдениях нами использовалась минимальная глубина сканирования.
ЭЦ была проведена 56 пациентам. Основным в алгоритме проведения ЭЦ был подбор подходящего витального красителя для витальной окраски слизистой оболочки желудка и времени его экспозиции. С этой целью нами были апробированы водные растворы метиленового синего (39 исследований) и толуидинового синего (15 исследований) различных концентраций. При использовании толуидинового синего в концентрациях 0,7 – 1,0% (12 исследований) в во всех случаях ядра эпителиоцитов хорошо дифференцировались, однако были отмечены различной степени выраженности геморрагические реакции слизистой оболочки, что в ряде случаев снижало информативность исследования. В то же время 0,4 – 0,6% раствор толуидинового синего (3 исследования) не обеспечил адекватной степени окраски ядер эпителиоцитов. Стандартная для эндоскопических исследований концентрация – 0,5% раствора метиленового синего также не обеспечила необходимой степени окраски клеточных элементов. Было установлено, что наиболее информативное эндоцитоскопическое изображение обеспечивается при использовании 1% водного раствора метиленового синего. Кроме того, нами был осуществлен подбор времени экспозиции красителя и было выявлено, что максимально интенсивная окраска ядер эпителиоцитов выявляется при экспозиции 5 минут после орошения слизистой оболочки желудка красителем. Как и при проведении КЛЭ, перед ЭЦ необходимо тщательное отмывание слизистой оболочки желудка от муцинозного налета с использованием раствора симетикона. После окраски слизистой оболочки раствором метиленового синего для удаления избытка красителя с поверхности слизистой оболочки через спрей-катетер производилось ее отмывание водой. Эндоцитоскопическое видеоизображение формировалось при прямом контакте дистального конца эндоцитоскопа со слизистой оболочкой, причем необходимо учитывать степень интенсивности контакта, так как излишнее усилие может привести к травматизации слизистой оболочки, экстравазации и заполнению поля зрения эритроцитами.
Нами было отмечено, что проведение в один день КЛЭ и ЭЦ снижает информативность обоих исследований. Выполнение КЛЭ после ЭЦ с витальной окраской слизистой оболочки метиленовым синим приводит к размытости эндомикроскопического изображения и отсутствию возможности визуализации отдельных клеточных элементов. Применение ЭЦ после КЛЭ также затруднено, что обусловлено реакцией между метиленовым синим и флуоресцеином натрия, выделяющимся из капилляров слизистой оболочки желудка, и, в результате – снижением объема активного красителя. Таким образом, рациональным представляется проведение КЛЭ и ЭЦ с промежутком в 2 - 3 суток. За этот период времени отмечается полная элиминация флуоресцеина натрия из слизистой оболочки желудка после КЛЭ. Окраска слизистой оболочки желудка метиленовым синим за 2 - 3 суток также полностью нивелируется.
При выполнении КЛЭ и ЭЦ нами оценивались различные тканевые структуры слизистой оболочки желудка, в частности – форма, размер сосочкой или валиков слизистой оболочки желудка, упорядоченность их расположения, наличие железистых структур в поверхностных слоях слизистой оболочки, форма, размер желез и их выводных протоков, наличие псевдомногорядности эпителия, размер и форма внутрисосочковых капиллярных петель,. При оценке клеточных структур исследовалась форма, размер как самих эпителиоцитов, так и их ядер, полярность их расположения, ядерно-цитоплазматическое отношение, наличие бокаловидных клеток. Дополнительно при ЭЦ оценивалась интенсивность окраски ядер эпителиоцитов метиленовым синим.
Аденома желудка с умеренной дисплазией эпителия характеризовалась наличием вытянутой формы желез в поверхностных слоях слизистой оболочки, замещающих нормальные сосочки. При этом длина эпителиоцитов и их ядер значительно увеличена, форма их веретенообразная, ядерно-цитоплазматическое отношение несколько увеличено. Полярность расположения эпителиоцитов и их ядер при аденоме с умеренной дисплазией эпителия не потеряна. Признаками появления фокусов тяжелой дисплазии эпителия явились в дополнение к вышеуказанным появление псевдомногорядности эпителия, неправильная форма ядер эпителиоцитов, дальнейшее увеличение их размера. Кроме того, с нарастанием степени дисплазии эпителия увеличивается и степень окраски ядер эпителиоцитов при ЭЦ. Точность сочетанной КЛЭ и ЭЦ в диагностике аденомы желудка и оценке степени дисплазии ее эпителия составила 91,3%.
Нами было выявлено, что четкими критериями (точность сочетанной КЛЭ и ЭЦ – 98,4%) внутрислизистой высокодифференцированной аденокарциномы желудка являются разрушение регулярной сосочковой структуры появление древовидной формы желез в поверхностных слоях слизистой оболочки и разрушение не менее 20% их в поле зрения, деформация, увеличение и полиморфизм ядер клеток с потерей их полярности и значительным увеличением ядерно-цитоплазматического отношения. Кроме того, при ЭЦ отмечается выраженная гиперхромия ядер опухолевых клеток.
Таким образом, КЛЭ и ЭЦ являются высокоэффективными методами оценки микроструктуры слизистой оболочки желудка, позволяющими исследовать тканевую и клеточную ее составляющие. На основании проводимого в МНИОИ им. П.А. Герцена исследования разработаны эндомикроскопические и эндоцитоскопические критерии различных этапов локальной неопластической прогрессии слизистой оболочки желудка.
